Inmunoensayos competitivos vs. tipo sándwich en hormonas | Endocrinología · Día 19

Programa de Endocrinología · R1 · Día 19 de 1 095 · Bloque: Laboratorio endocrino, inmunoensayos e interferencias

Una mujer de 34 años llega derivada como «hipertiroidismo por Graves»: TSH suprimida, T4 libre alta, anticuerpos contra el receptor de TSH positivos. No tiene bocio, no tiene taquicardia, no ha perdido peso. Toma un suplemento «para el cabello y las uñas» con 10 mg de biotina al día. Ningún dato del laboratorio era real. Si entiendes cómo está construido cada inmunoensayo, este caso se resuelve antes de pedir una gammagrafía.

Con este tema empezamos un bloque dedicado al laboratorio endocrino. La idea es simple: casi toda la endocrinología se diagnostica con cifras que vienen de inmunoensayos, y cada formato tiene sus puntos ciegos. Hoy vemos los dos grandes diseños, el competitivo y el tipo sándwich, y lo que de ellos se deduce para interpretar un resultado que no cuadra.

Lo esencial

• Los ensayos competitivos se usan para moléculas pequeñas (T4, T3, cortisol, esteroides sexuales, vitamina D): la señal es inversamente proporcional a la concentración.
• Los ensayos tipo sándwich (inmunométricos) se usan para péptidos y proteínas grandes (TSH, LH, FSH, prolactina, PTH, insulina, hCG, troponina): la señal es directamente proporcional.
• La biotina en dosis altas baja falsamente los resultados en los ensayos sándwich y los sube falsamente en los competitivos que usan el sistema biotina-estreptavidina. El patrón resultante puede imitar un Graves.
• Los anticuerpos heterófilos suelen elevar falsamente los ensayos sándwich al formar un puente entre los dos anticuerpos.
• Cuando el resultado no encaja con la clínica, la secuencia práctica es: preguntar por suplementos y fármacos, repetir en otra plataforma, hacer diluciones seriadas y, si hace falta, usar tubos bloqueantes, precipitación con polietilenglicol o espectrometría de masas.

Un inmunoensayo en una frase

Un inmunoensayo mide una sustancia aprovechando que un anticuerpo la reconoce de forma específica. Lo que cambia entre formatos es cómo se convierte esa unión en una señal medible (quimioluminiscencia, fluorescencia, enzima) y cuántos anticuerpos intervienen. La mayoría de los analizadores automatizados que hay en los laboratorios de la región funcionan con quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia, y muchos usan el sistema biotina-estreptavidina para fijar el complejo a una fase sólida. Ese detalle técnico, que parece de ingeniería, es el responsable de una de las interferencias más frecuentes de la última década.

Ensayos competitivos

Cómo funcionan

En la muestra hay una cantidad desconocida de hormona. El reactivo trae una cantidad fija de la misma hormona marcada y una cantidad limitada de anticuerpo. La hormona del paciente y la marcada compiten por los mismos sitios de unión. Cuanta más hormona tenga el paciente, menos marcada se une y menor es la señal. La curva de calibración es inversa.

Por qué se usan para moléculas pequeñas

Una molécula pequeña como la tiroxina o el cortisol solo ofrece un epítopo útil: no caben dos anticuerpos a la vez. Por eso no se puede construir un sándwich y se recurre a la competición.

Debilidades

• Menor sensibilidad en concentraciones bajas. La señal máxima corresponde a concentración cero, y distinguir valores muy bajos exige detectar pequeñas caídas de una señal alta. Es la razón por la que los inmunoensayos de testosterona y estradiol son poco fiables en mujeres, niños y hombres en tratamiento antiandrogénico, y por la que la espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) es preferible en esos contextos.
• Reactividad cruzada. Los esteroides se parecen mucho entre sí. Los ensayos de cortisol pueden reconocer prednisolona o 11-desoxicortisol (relevante en la prueba de metirapona o en el déficit de 11β-hidroxilasa) y sobrestimar el cortisol real.
• Interferencia por proteínas transportadoras. En las mediciones de hormonas libres por métodos de análogo, las alteraciones de las proteínas transportadoras (embarazo, hipertiroxinemia disalbuminémica familiar, heparina que libera ácidos grasos in vitro) pueden falsear la T4 libre.

Hormonas que suelen medirse por competición

T4 total y libre, T3 total y libre, cortisol, testosterona, estradiol, progesterona, 25-hidroxivitamina D, DHEA-S, aldosterona en algunas plataformas, y los anticuerpos contra el receptor de TSH (TRAb), que en la mayoría de las plataformas se miden por competición con un anticuerpo monoclonal estimulante.

Ensayos tipo sándwich (inmunométricos)

Cómo funcionan

Se usan dos anticuerpos dirigidos contra epítopos distintos de la misma molécula. El anticuerpo de captura está fijado a una fase sólida (o lleva biotina para unirse a una superficie recubierta de estreptavidina). El anticuerpo de detección lleva la marca. La hormona queda atrapada entre los dos. Cuanto más hormona, más señal. La curva es directa.

Ventajas

• Alta sensibilidad: permite medir concentraciones muy bajas con precisión. Los ensayos de TSH de tercera generación tienen una sensibilidad funcional de alrededor de 0,01–0,02 mUI/L, lo que permite separar una TSH suprimida de una solo baja.
• Alta especificidad: hacen falta dos reconocimientos independientes para generar señal.
• Amplio rango de medición.

Debilidades

• Anticuerpos heterófilos y anticuerpos humanos antianimal. Si el paciente tiene anticuerpos capaces de unirse a los dos anticuerpos del reactivo (de ratón, por lo general), forman un puente sin que exista hormona y generan una señal falsa. El resultado típico es una elevación espuria.
• Efecto gancho (hook). En los formatos de un solo paso, una concentración enorme de hormona satura por separado ambos anticuerpos e impide que se formen sándwiches. El resultado sale falsamente bajo o normal. Es el tema de mañana.
• Variantes de la molécula. Formas de TSH con baja actividad biológica, macroprolactina o fragmentos de PTH pueden ser reconocidos de forma distinta por cada plataforma.

Hormonas que suelen medirse por sándwich

TSH, LH, FSH, prolactina, GH, ACTH, PTH intacta, insulina, péptido C, hCG, tiroglobulina, calcitonina, IGF-1 en muchas plataformas y la troponina cardiaca.

Comparación directa

Característica	Competitivo	Sándwich (inmunométrico)
Tamaño del analito	Pequeño, un epítopo	Grande, al menos dos epítopos
Relación señal-concentración	Inversa	Directa
Anticuerpos	Uno, en cantidad limitante	Dos, en exceso
Sensibilidad a concentraciones bajas	Menor	Mayor
Reactividad cruzada	Más frecuente	Menos frecuente
Biotina en exceso (sistemas biotina-estreptavidina)	Resultado falsamente alto	Resultado falsamente bajo
Anticuerpos heterófilos	Efecto variable	Habitualmente falsamente alto
Efecto gancho	No aplica	Posible en un solo paso
Ejemplos	T4L, T3L, cortisol, testosterona, estradiol, TRAb	TSH, PRL, LH, FSH, PTH, insulina, hCG

Biotina: la interferencia que aprendimos tarde

La biotina (vitamina B7) se vende en dosis de 5 a 10 mg, y algunas formulaciones llegan a 100 mg por comprimido, cientos de veces el requerimiento diario de unos 30 µg. En dosis altas se usó también en ensayos de esclerosis múltiple progresiva, con hasta 300 mg al día. La FDA emitió una alerta en 2017 y la actualizó en noviembre de 2019, después de un caso fatal con un ensayo de troponina falsamente bajo en un paciente que tomaba biotina.

Por qué cambia el resultado en sentidos opuestos

La biotina libre de la muestra ocupa los sitios de la estreptavidina en la fase sólida.

• En un ensayo sándwich, el complejo hormona-anticuerpos no puede fijarse: hay menos señal y el resultado sale falsamente bajo. TSH baja, PTH baja, troponina baja.
• En un ensayo competitivo con el mismo sistema, la menor señal se interpreta como mucha hormona: el resultado sale falsamente alto. T4 libre alta, T3 libre alta, TRAb alto, cortisol alto.

El patrón TSH baja más T4 libre y T3 libre altas más TRAb positivo es exactamente el del caso con el que empezamos: un Graves bioquímico perfecto en un paciente eutiroideo.

Qué hacer

• Pregunta siempre por suplementos, en particular los de cabello, piel y uñas, los multivitamínicos y los productos para «energía» o «metabolismo».
• La vida media de la biotina es corta, de unas pocas horas. Algunos laboratorios recomiendan tomar la muestra al menos 8 horas después de una dosis habitual y al menos 72 horas después de megadosis (5 a 10 mg o más).
• La FDA advierte que no hay información suficiente para asegurar que una pausa fija evite siempre la interferencia, sobre todo con dosis muy altas o en insuficiencia renal. Ante duda, repite la medición en una plataforma que no use biotina-estreptavidina.
• Los fabricantes han ido modificando sus ensayos para tolerar más biotina, pero la tolerancia varía entre plataformas y entre analitos. Revisa la ficha técnica del ensayo que usa tu laboratorio.

Anticuerpos heterófilos y antianimal

Son anticuerpos humanos capaces de reconocer inmunoglobulinas de otras especies. Aparecen tras exposición a animales, vacunas, transfusiones, tratamientos con anticuerpos monoclonales murinos o en enfermedades autoinmunes, y también sin causa aparente. Afectan sobre todo a los ensayos sándwich, donde pueden unir los dos anticuerpos y dar falsos positivos.

Los ejemplos clásicos que vale la pena tener presentes son la hCG sérica positiva persistente en una mujer no embarazada (con riesgo de que se le indique quimioterapia o histerectomía por sospecha de enfermedad trofoblástica), la TSH alta con T4 libre normal que no baja pese a dosis crecientes de levotiroxina, y la calcitonina elevada que lleva a sospechar cáncer medular de tiroides.

Pistas de que hay una interferencia

• El resultado no concuerda con la clínica ni con otros parámetros (TSH alta con T4 libre alta y paciente eutiroideo, hCG sérica positiva con hCG urinaria negativa).
• La dilución seriada no es lineal: al diluir la muestra a la mitad, el resultado no baja a la mitad.
• El resultado cambia mucho al medirlo en otra plataforma.
• El valor disminuye tras incubar la muestra en tubos bloqueantes de anticuerpos heterófilos.

Una pista útil en el caso de la hCG: los anticuerpos heterófilos son IgG grandes que casi no pasan a la orina. Una hCG sérica positiva con hCG urinaria negativa (con suficiente concentración sérica para ser detectable en orina) es muy sugestiva de interferencia.

Macroprolactina: el falso positivo que no es interferencia

La macroprolactina es un complejo de prolactina con IgG, de gran tamaño, con poca actividad biológica y que se elimina lentamente. Se acumula y la miden casi todos los ensayos sándwich. Explica una proporción importante de las hiperprolactinemias asintomáticas, con menstruaciones normales y sin galactorrea. La guía de la Endocrine Society de 2011 sobre hiperprolactinemia recomienda buscarla en pacientes asintomáticos con prolactina alta. La prueba habitual es la precipitación con polietilenglicol: una recuperación de prolactina menor de alrededor del 40 % sugiere predominio de macroprolactina, aunque cada laboratorio debe usar sus propios puntos de corte y reportar idealmente la prolactina monomérica posprecipitación.

Algoritmo práctico ante un resultado que no encaja

1. Revisa la clínica. ¿El cuadro clínico es compatible? ¿Hay discordancia entre hormonas del mismo eje (TSH y T4 libre en la misma dirección sin explicación)?
2. Revisa la preanalítica. Hora de toma, ayuno, fármacos (heparina, glucocorticoides, estrógenos orales, amiodarona), suplementos (biotina), embarazo.
3. Repite en otra muestra y, si es posible, en otra plataforma con otro formato o sin biotina-estreptavidina.
4. Pide diluciones seriadas. La falta de linealidad orienta a interferencia por anticuerpos.
5. Tratamientos específicos de la muestra: tubos bloqueantes de heterófilos, precipitación con polietilenglicol (macroprolactina, macro-TSH).
6. Método de referencia cuando esté disponible: LC-MS/MS para esteroides y hormonas tiroideas.
7. Conversa con el laboratorio. El bioquímico clínico es tu aliado: cuéntale la sospecha.

En el laboratorio de la región: lo que conviene saber

En buena parte de los hospitales públicos del Perú y de Latinoamérica las pruebas hormonales se procesan en uno o dos analizadores automatizados, y muchas veces se derivan a laboratorios privados que usan otra plataforma. Eso tiene dos consecuencias prácticas. La primera es que un mismo paciente puede tener controles hechos con métodos distintos, y una «mejoría» o un «empeoramiento» pueden ser solo un cambio de plataforma. La segunda es que repetir la muestra en otro laboratorio, que en otros contextos sería un lujo, aquí suele estar al alcance y es la forma más barata de sospechar una interferencia.

La espectrometría de masas sigue siendo escasa fuera de las capitales, y los tubos bloqueantes de heterófilos no están disponibles en todas partes. Por eso la anamnesis farmacológica y las diluciones seriadas, que cualquier laboratorio puede hacer, son las herramientas más rentables.

Un caso para practicar

Varón de 58 años, en control por hipotiroidismo primario con levotiroxina 100 µg al día. Lleva un año con TSH entre 12 y 15 mUI/L pese a que se le subió la dosis dos veces; la T4 libre está en la parte alta del rango y él se siente bien, sin síntomas de hipotiroidismo. ¿Qué pensarías? Primero, adherencia y absorción (toma en ayunas, separación de calcio, hierro e inhibidores de la bomba de protones). Si todo eso está en orden, una TSH alta con T4 libre normal-alta en un paciente clínicamente eutiroideo obliga a pensar en interferencia del ensayo sándwich de TSH (heterófilos o macro-TSH) antes que en resistencia a hormona tiroidea o en un adenoma productor de TSH. La dilución seriada y la medición en otra plataforma suelen resolverlo. Subir la dosis una tercera vez, no.

Cifras y dosis que se usan de verdad

Parámetro	Cifra práctica
Requerimiento diario de biotina	Alrededor de 30 µg
Dosis habituales en suplementos de «belleza»	5–10 mg/día (hasta 100 mg/comprimido en algunos productos)
Pausa sugerida antes de la muestra con dosis habituales	≥8 horas
Pausa sugerida tras megadosis (≥5 mg)	≥72 horas, sin garantía absoluta
Sensibilidad funcional de TSH de tercera generación	~0,01–0,02 mUI/L
Recuperación de prolactina tras PEG que sugiere macroprolactina	Menor de ~40 % (según punto de corte local)
Dilución que confirma linealidad	El resultado ajustado debe mantenerse proporcional en diluciones seriadas

Perlas y errores frecuentes

• Tratar el laboratorio y no al paciente. Antes de iniciar antitiroideos o indicar cirugía por un resultado inesperado, confirma.
• Olvidar que «suplemento natural» incluye biotina. El paciente rara vez lo menciona si no le preguntas.
• Pedir testosterona total por inmunoensayo en una mujer con hirsutismo y fiarse del valor bajo. En concentraciones bajas el inmunoensayo es impreciso. Si la clínica sugiere hiperandrogenismo, busca LC-MS/MS.
• Comparar resultados de distintos laboratorios como si fueran intercambiables. Cada plataforma tiene su sesgo. Para el seguimiento, usa siempre el mismo laboratorio cuando se pueda.
• Ignorar la macroprolactina. Una resonancia hipofisaria pedida por una prolactina de 60 ng/mL en una mujer con ciclos normales puede mostrar un incidentaloma y abrir una cadena de estudios innecesarios.
• Pensar que la troponina queda fuera de este tema. Es un ensayo sándwich, y la biotina puede producir falsos negativos en un infarto.

Qué dice la guía y la evidencia

No hay una guía clínica única sobre formatos de inmunoensayo, pero las referencias de consenso son claras. La revisión de Ghazal y colaboradores publicada en Annals of Laboratory Medicine (actualización 2021) resume los mecanismos de interferencia en inmunoensayos hormonales, incluidos reactividad cruzada, anticuerpos heterófilos, biotina y anticuerpos antianalito, y propone estrategias de detección. La revisión de Favresse y colaboradores en Endocrine Reviews (2018) ofrece un algoritmo de detección específico para pruebas de función tiroidea. La FDA mantiene su comunicación de seguridad sobre biotina, actualizada en 2019. Para la macroprolactina, la referencia sigue siendo la guía de práctica clínica de la Endocrine Society de 2011.

Continúa el programa

Ayer cerramos el bloque de fisiología con el tejido adiposo como órgano endocrino: leptina, adiponectina y balance energético. Mañana seguimos con el efecto gancho en los inmunoensayos de dos sitios, la causa de que un macroprolactinoma pueda informarse con una prolactina apenas elevada. El calendario completo está en la página del Programa de Endocrinología.

Referencias

1. Ghazal K, Brabant S, Prie D, Piketty ML. Hormone immunoassay interference: a 2021 update. Ann Lab Med. 2022;42(1):3-23. doi:10.3343/alm.2022.42.1.3. Disponible en: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8368230
2. Favresse J, Burlacu MC, Maiter D, Gruson D. Interferences with thyroid function immunoassays: clinical implications and detection algorithm. Endocr Rev. 2018;39(5):830-50. doi:10.1210/er.2018-00119
3. Sturgeon CM, Viljoen A. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Ann Clin Biochem. 2011;48(Pt 5):418-32. doi:10.1258/acb.2011.011073
4. U.S. Food and Drug Administration. UPDATE: The FDA warns that biotin may interfere with lab tests: FDA safety communication. 5 de noviembre de 2019. Resumen disponible en: https://www.tctmd.com/news/fda-reminds-clinicians-about-biotin-interference-troponin-tests
5. Melmed S, Casanueva FF, Hoffman AR, Kleinberg DL, Montori VM, Schlechte JA, et al. Diagnosis and treatment of hyperprolactinemia: an Endocrine Society clinical practice guideline. J Clin Endocrinol Metab. 2011;96(2):273-88. doi:10.1210/jc.2010-1692

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